經(jīng)典品讀匯 | 《豬病學(xué)》第11版之“經(jīng)典豬瘟”篇（下）
豬瘟病毒檢測(cè)
根據(jù)毒株毒力、檢測(cè)方法和樣本，CSFV一般可在感染后24小時(shí)內(nèi)檢測(cè)出來(lái)(Liu et al. 2011)。病毒可以從加有肝素或EDTA的全血、血清血漿和血沉層中分離。最有可能富含CSFV的組織有扁桃體、脾臟、腎臟、回盲淋巴組織和咽喉淋巴結(jié)。
盡管病毒分離是確認(rèn)病毒感染的重要參考方法，但耗時(shí)費(fèi)力，不適合控制病毒進(jìn)一步傳播的快速反應(yīng)需求。使用病毒分離的目的是分離毒株，對(duì)病毒特性進(jìn)行鑒定以便于疫苗的進(jìn)一步研究。CSFV可用豬腎細(xì)胞系(PK15或SK6 )進(jìn)行分離，關(guān)鍵是所用的細(xì)胞、培養(yǎng)基和試劑都要確保沒(méi)有瘟病毒及抗體存在。
qRT-PCR是目前較好的檢測(cè)病毒RNA的方法。這些方法具有高敏感性（診斷和分析）和特異性，特別是探針?lè)?span style="color: rgb(51, 51, 51); letter-spacing: 1px;">(Hoffmann et al.2005, 2011; Le Potier et al.2006)。很多CSFV特異性qRT-PCR試劑盒已經(jīng)商業(yè)化。操作步驟都是特為檢 C 株活病毒基因組設(shè)計(jì)的，還可以同時(shí)檢測(cè) CSFV 和 ASFV 基因組的試劑盒(Haines et al.2013)。
qRT-PCR可用于多種樣品CSFV感染的檢測(cè)，但主要是全血、棉拭子和組織樣品。此外，血清、血漿和白細(xì)胞也可以。用于病毒分離的樣品包括扁桃體、脾臟、回腸和淋巴結(jié)，但腎臟組織可能敏感性較差。
高質(zhì)量的新鮮樣品最好，病毒RNA可存在于滅活組織中，病毒分離可能會(huì)因組織自融等原因未分離到。例如來(lái)自野豬的樣品（Petrov 等 2014）。病毒RNA可以長(zhǎng)時(shí)間在一些組織中檢測(cè)到（例如可以在至少康復(fù)9周的豬扁桃體中檢測(cè)到病毒RNA）(Blome et al.2006)。
利用qRT-PCR方法擴(kuò)增病毒基因組片段，可以區(qū)分CSFV、BVDV、BDV甚至CSFV不同毒株(Zhang et al.2012)。根據(jù)疫苗和被檢測(cè)樣品，qRT-PCR可以用DIVA方法檢測(cè)（可區(qū)分野毒株和疫苗毒株）。最近研發(fā)的C株特異性qRT-PCR試劑盒可以用于檢測(cè)免疫弱毒疫苗的動(dòng)物，但是檢測(cè)到陽(yáng)性結(jié)果不能排除野毒感染的可能性。特異性區(qū)別野毒和疫苗毒的PCR方法(Liu et al.2009; Zhao et al.2008) 可以檢測(cè)或排除野毒感染(Blome et al.2011)。
高度敏感的qRT-PCR可用于混合樣品的檢測(cè)(Depner et al.2007; Le Dimna et al.2008)，這樣可以顯著提高檢測(cè)量。但也有其它方面的考慮，包括準(zhǔn)備混合樣品的時(shí)間，重新檢測(cè)單個(gè)陽(yáng)性樣品所需要時(shí)間。為了避免敏感性降低，需要掌握操作方法的詳細(xì)資料，并對(duì)RNA水平進(jìn)行檢測(cè)，在混合樣品前還需要比較臨床病例和免疫豬群的特點(diǎn)。
通常情況下，qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果為陰性通常認(rèn)為未感染，但檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性并不意味著動(dòng)物感染了CSFV(Haegeman et al.2006)。
抗原捕獲ELISA被用于活豬早期CSFV感染的診斷；雙夾心ELISA是針對(duì)多種病毒抗原的單抗或者多抗為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法，血清、血漿及血沉棕黃層、加入肝素或EDTA及組織勻漿都可以采用這些方法檢測(cè)。這些方法操作簡(jiǎn)單，也不需要組織培養(yǎng)設(shè)備，操作簡(jiǎn)單，并在36小時(shí)內(nèi)出結(jié)果(Depner et al.1995)，但也要認(rèn)識(shí)到抗原捕獲ELISA的局限性。目前所用的商業(yè)化試劑盒敏感性都比細(xì)胞VI低(Blome et al.2006)。另外，這些方法檢測(cè)仔豬血清樣品的敏感性要比來(lái)自成年母豬或者亞臨床癥狀和輕微癥狀的豬要高(Anonymous，2002)。為了彌補(bǔ)檢測(cè)方法敏感性的不足，所有表現(xiàn)異常的豬群都要檢測(cè)。這些方法特異性較差，并會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，因此，抗原捕獲ELISA僅用于有臨床癥狀或符合豬瘟病變和監(jiān)測(cè)近期疑似感染的豬群。
盡管FAT能用于冰凍切片病毒抗原的檢測(cè)，敏感性高，可批量檢測(cè)，但該方法很快被qRT-PCR代替，可用于將來(lái)豬瘟爆發(fā)時(shí)的檢測(cè)。
豬瘟抗體檢測(cè)
病毒中和試驗(yàn)（VN）是檢測(cè)CSFV特異性抗體的參考方法。CSFV中和抗體水平可用血清終點(diǎn)滴定法測(cè)定。但是VN要求高質(zhì)量血清及細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。因?yàn)閂N法通常需要 3-5 天時(shí)間才能出結(jié)果，因此不適合常規(guī)大規(guī)模測(cè)定。
由于不同瘟病毒間存在抗體交叉反應(yīng)，VN實(shí)驗(yàn)?zāi)軝z測(cè)動(dòng)物感染的病毒類(lèi)型。VN檢測(cè)需要兩個(gè)或多個(gè)重復(fù)，CSFV中和抗體的效價(jià)要與BVDV、BDV參考毒株的中和抗體效價(jià)進(jìn)行比較，效價(jià)差別4倍或以上可以認(rèn)為是最高中和抗體效價(jià)的病毒感染(Anonymous，2002)。這種方法通常用于疾病爆發(fā)豬場(chǎng)周?chē)渌i場(chǎng)控制措施解除前的檢測(cè)。
ELISA方法可用于流行病學(xué)調(diào)查，監(jiān)測(cè)無(wú)CSFV區(qū)域非常實(shí)用。競(jìng)爭(zhēng)ELISA是建立在用抗CSFV血清與針對(duì)于CSF E2蛋白的特異性單克隆抗體基礎(chǔ)上，利用競(jìng)爭(zhēng)ELISA可以減少與其它瘟病毒抗體的交叉反應(yīng)，常用的包被抗原是用昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)的E2(gp55)抗原。CSFV感染后10-15天可用ELISA檢測(cè)到抗體，這與中和抗體出現(xiàn)的時(shí)間相似。
Erns（rns應(yīng)為上標(biāo)）‐ELISAs被開(kāi)發(fā)為用于E2亞單位疫苗接種群體的差異對(duì)照試驗(yàn)。近年來(lái)，其它Erns（rns應(yīng)為上標(biāo)）‐ELISAs已被開(kāi)發(fā)用作為ELISA對(duì)照(Aebischer et al.2013)。然而在建議將其作為與新標(biāo)記嵌合疫苗CP7-E2Alf的鑒別診斷的對(duì)照試驗(yàn)前，作為商業(yè)性ELISAs仍有改進(jìn)空間(Schroeder et al.2012)。
免疫
盡管CSFV能引起免疫抑制，但豬只感染恢復(fù)后能產(chǎn)生中和抗體。中和抗體由囊膜糖蛋白E2產(chǎn)生，囊膜蛋白Erns （rns應(yīng)為上標(biāo)）和非結(jié)構(gòu)蛋白N能誘導(dǎo)非中和抗體的產(chǎn)生。在感染病毒后10-20天，中和抗體可以清除病毒。
CSFV特異性中和抗體和特異性殺傷細(xì)胞是重要的免疫應(yīng)答反應(yīng)(Renson et al.2014)。細(xì)胞免疫和中和抗體的雙組合可以提供快速、完全的保護(hù)，將病毒清除。但是每一種免疫反應(yīng)均具有避免CSFV引起的致命感染的效果。E2亞單位疫苗能誘導(dǎo)高水平的中和抗體保護(hù)豬只(Bouma et al.1999)，也能保護(hù)相關(guān)瘟病毒或嵌合病毒的實(shí)驗(yàn)室感染，但未檢測(cè)到針對(duì)這些病毒的中和抗體(Reimann et al. 2004; Voigt et al.2007)。
已免疫或者感染過(guò)的豬對(duì)病毒的再次感染有一定的抵抗力。CSFV是相對(duì)穩(wěn)定的RNA病毒，并且在不同毒株間甚至BVDV和CSFV間都存在交叉保護(hù)(Leforban et al.1992) 。仔豬的母源抗體保護(hù)力能持續(xù)8-12周，這主要取決于初乳中的中和抗體水平(Kaden and Lange，2004)，但同時(shí)也能干擾疫苗免疫反應(yīng)(Vandeputte et al.2001)。
預(yù)防和控制
豬瘟是一種全球性流行疫病，盡管一些地區(qū)已經(jīng)根除，但在根除和流行區(qū)域的邊界及一些野豬群中仍然存在(Laddomada，2000)。根除區(qū)域再次感染CSFV的風(fēng)險(xiǎn)依舊很高，根除地區(qū)的生產(chǎn)者和獸醫(yī)在檢測(cè)CSFV的爆發(fā)中發(fā)揮了重要作用，但是早期檢測(cè)需要預(yù)警和對(duì)臨床癥狀等進(jìn)行培訓(xùn)。
為了滿(mǎn)足國(guó)際貿(mào)易需求，無(wú)CSFV地區(qū)采取不免疫政策，即通過(guò)銷(xiāo)毀被感染或者可疑豬群及實(shí)施檢測(cè)來(lái)控制豬瘟(Anonymous，2001)。歐洲在根除豬瘟后也重申不免疫，這種做法尤其適合養(yǎng)豬密度高的地區(qū)。因?yàn)檫@些地區(qū)存在很多增加該病傳播風(fēng)險(xiǎn)的因素(Koenen et al.1996; Mintiens et al. 2003)。在某些情況下，像1997年荷蘭爆發(fā)豬瘟，限制屠宰豬只轉(zhuǎn)移，避免了大量動(dòng)物被安樂(lè)死。疫苗接種區(qū)至少一年禁止國(guó)際貿(mào)易，因此疫苗的使用影響了經(jīng)濟(jì)效益，但是面對(duì)豬瘟爆發(fā)，將來(lái)還是要考慮疫苗緊急接種。
目前有很多可供選擇使用的豬瘟疫苗，包括著名的中國(guó)C株、Thiverval株，新型能用于區(qū)分野毒和疫苗毒的標(biāo)記疫苗(Blome et al.2017)。傳統(tǒng)的活疫苗能夠產(chǎn)生高水平的保護(hù)力，并在免疫2周后產(chǎn)生中和抗體(Dahle and Liess，1995)。免疫間隔達(dá)6-10個(gè)月，免疫途徑（肌肉或口服）影響不大(Kaden and Lange，2001; Kaden et al.2008)。弱毒活疫苗最大的缺點(diǎn)是不能與野毒感染所產(chǎn)生的抗體進(jìn)行區(qū)分。
商品化的重組E2亞單位疫苗提供了一種區(qū)分疫苗免疫動(dòng)物的方法。已經(jīng)進(jìn)行了E2標(biāo)記疫苗的免疫攻毒和傳播實(shí)驗(yàn)的效果評(píng)估，但效果不一。單次免疫3周后接種CSFV能防止臨床癥狀的發(fā)生并降低死亡率(Bouma et al.1999)，免疫后至少需要2周時(shí)間才能提供臨床保護(hù)(Bouma et al.2000; Uttenthal et al.2001)。免疫后攻毒過(guò)早，疫苗不能提供臨床保護(hù)，也不能減少病毒的攜帶量(Uttenthal et al.2001)。
E2標(biāo)記疫苗的效果評(píng)估顯示，即使免疫2次，在第二次免疫后14天用CSFV攻毒，病毒仍可通過(guò)胎盤(pán)屏障，通過(guò)2次疫苗免疫能防止妊娠母豬出現(xiàn)臨床癥狀，但不能阻止CSFV的水平和垂直傳播(Dewulf et al.2001b)。因此，在多數(shù)緊急免疫時(shí)，免疫動(dòng)物不能阻止CSFV通過(guò)胎盤(pán)感染，疫苗不能控制“帶毒母豬綜合征”，最終導(dǎo)致豬瘟的遲發(fā)性感染。
目前，構(gòu)建以遺傳工程為基礎(chǔ)的CSF疫苗研發(fā)為主要方向，有5個(gè)策略：CSFV免疫多肽、DNA疫苗、表達(dá)CSFV蛋白的病毒載體疫苗、嵌合瘟病毒和反向轉(zhuǎn)錄缺失CSF基因（復(fù)制子）(Blome et al. 2017)。嵌合性瘟病毒CP7-E2Alf在被廣泛評(píng)估其安全性和效力后獲得許可(Gabriel et al.2012)。無(wú)論何種途徑接種(口服還是肌肉注射)，它都能誘導(dǎo)產(chǎn)生良好的免疫保護(hù)，防止病毒進(jìn)一步傳播，在育肥豬和妊娠母豬中也很安全。母源抗體(Eble et al.2014)或BVDV-1抗體(Drager et al.2016)似乎不會(huì)顯著干擾疫苗的效果。該疫苗可用于緊急接種，以控制豬瘟在家豬或野豬中的傳播。如果有一個(gè)完全有效的配套工具包，其DIVA疫苗是一個(gè)非常有價(jià)值的工具，控制疫情，同時(shí)進(jìn)行血清學(xué)監(jiān)測(cè)。
野豬豬瘟
野豬是CSFV的潛在宿主，大部分家豬爆發(fā)豬瘟可歸結(jié)于野豬的傳播(52%，F(xiàn)ritzemeier et al. 2000)。因此，自上世紀(jì)90年代以來(lái)，為限制CSFV在野豬群中的廣泛傳播，歐盟成功地實(shí)施了大規(guī)?？诜柏i疫苗(Rossi et al.2015)。CSFV感染對(duì)野豬似乎是無(wú)害的，因?yàn)樵谶^(guò)去的爆發(fā)中很少有死亡報(bào)告。在自然或人為屏障存在的情況下，野豬種群中的CSFV可以被限制在一個(gè)特定的區(qū)域內(nèi)，直到最終被消除(Pol et al.2008)。
控制野豬CSFV的經(jīng)典措施包括減少狩獵，使病毒在易感群體中傳播，并導(dǎo)致死亡或免疫，然后對(duì)最易感動(dòng)物(幼豬和幼母豬)進(jìn)行有針對(duì)性的狩獵。在一些難以用標(biāo)準(zhǔn)方法根除CSFV的地區(qū)，已經(jīng)嘗試使用混合在口服誘餌中的C株口服活疫苗接種(Kaden等，2000)。該疫苗的安全性已在其它野生動(dòng)物中得到證實(shí)(Chenut et al.1999)。
口服疫苗可在10天內(nèi)誘導(dǎo)豬只產(chǎn)生較強(qiáng)的保護(hù)性免疫(Kaden and Lange，2001)。然而最近對(duì)口服疫苗野外接種數(shù)據(jù)分析表明，需3倍劑量的口服疫苗才能對(duì)野豬提供足夠的保護(hù)力。大多數(shù)研究表明，由于難以獲得誘餌，幼齡豬沒(méi)有獲得足夠的保護(hù)性免疫(Kaden et al.2002)。如果將疫苗用于預(yù)防，并在病毒進(jìn)入該地區(qū)前至少一年進(jìn)行接種，則疫苗接種似乎更有效，從而為實(shí)現(xiàn)高水平的群體免疫提供了時(shí)間。為預(yù)防疾病的傳播，建議在疫情爆發(fā)前進(jìn)行常規(guī)疫苗接種(Rossi等，2010年)。
使用疫苗后，能區(qū)分野毒和疫苗免疫野豬的唯一方法是通過(guò)DIVA qRT‐PCR檢測(cè) (Leifer等，2009)。因此，很難決策何時(shí)停止接種疫苗。CSFV抗體可持續(xù)多年，并在大規(guī)模口服疫苗免疫后進(jìn)行監(jiān)測(cè)。因此，建議加強(qiáng)陽(yáng)性監(jiān)測(cè)，以便發(fā)現(xiàn)病死野豬。然而，由于在自然界中很少發(fā)現(xiàn)尸體，因此建議結(jié)合對(duì)幼畜的血清學(xué)監(jiān)測(cè)和數(shù)據(jù)建模，以確定幼畜血清價(jià)超過(guò)5%為預(yù)警點(diǎn)。在這些地域，應(yīng)實(shí)施有針對(duì)性的血清學(xué)和病毒學(xué)監(jiān)測(cè)(Saubusse et al.2016)。在未來(lái)，口服DIVA疫苗是很有價(jià)值的，通過(guò)血清學(xué)監(jiān)測(cè)及時(shí)發(fā)現(xiàn)野毒的傳播。嵌合性瘟病毒CP7-E2alf是目前最有希望用于口服的候選活疫苗。
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Peter D. Kirkland, Marie‐Frédérique Le Potier, and Deborah Finlaison（著）
李明明 郭海榮（譯）/徐大為（校）